目的：
對于剛接觸HPLC的工作人員來說，在實驗前感覺有很多事情都要同時去做，且思路不是很清晰。現(xiàn)在，就用十個步驟來說明用HPLC測定藥品含量的全過程，供大家參考。
儀器：
安捷倫1100型HPLC（A、B、C、D四元泵，配200mm的C18柱）
藥品：
頭孢噻肟鈉（頭孢類無菌原料）
關鍵詞：
HPLC、色譜柱、步驟、流動相、基線、平衡、天平、溶解、校正因子、含量測定
安捷倫1100型HPLC圖1：
第一步：準備工作

拿到樣品，我首先查找該藥品的含量檢測標準，熟悉實驗中用到哪些器具、試劑、工具等。因此，我準備了藥勺、鑷子、容量瓶、燒杯、滴管、移液管等，并領取工作對照品。

登記對照品領用記錄。

在本步驟中應該注意：

1.用到的容量瓶、移液管等均應經(jīng)計量部門校正合格，并在有效期內(nèi)使用。

2.我用的對照品是中檢所提供。一般的對照品來源有兩種，一種是來自中檢所，為一級對照品；一種是用中檢所對照品標定原料藥，用此原料藥作為對照品，為二級對照品。

第二步：裝色譜柱、沖水
選擇藥品標準中該品種規(guī)定的色譜柱（本實驗用200mm的C18柱）接于HPLC，并在儀器A通道上放置新制的超純水。打開HPLC和工作站，儀器自檢完畢后，打開沖洗閥、選擇水的連接通道（A通道）、調節(jié)流速至3ml/min，約5-8min后，使原來保存在泵前管路內(nèi)的流動相被水替換，并排走管路內(nèi)的氣泡后，關閉沖洗閥；調節(jié)流速至0.5ml/min，并保存此時水的方法，開始用水沖洗色譜柱。理論上，20cm色譜柱的沖洗時間大約為30-40min。在本步驟中應該注意：
1.色譜柱在安裝時要注意流向，不要接反。
2.超純水超的制取，我是從超純水機中獲得；還可以用純化水經(jīng)0.45um的水系膜過濾2遍得到。
3.為防止色譜柱內(nèi)填料被水沖壞，可添加5%-10%的有機溶劑（乙腈或甲醇）。

第三步：配制流動相（此時HPLC在沖水）
按照標準規(guī)定的流動相配制方法，配制該樣品的流動相。配置流動相用時30-40min。
登記流動相配置記錄。
在本步驟中應該注意:
1.有的HPLC帶有真空脫氣裝置，如安捷倫1100。但也有的儀器沒有，如島津的一些型號，所以在流動相進液相色譜儀前一定要排好氣泡。最簡單的方法就是超聲，一般超聲10-15min即可。
2.如果標準方法規(guī)定流動相為有機系和水系混合物，如本實驗。則流動相在進HPLC前，一定要保證混合均勻，以免在進樣后出現(xiàn)前后兩針保留時間差別很大的現(xiàn)象。

第四步：走基線
1.把流動相放入HPLC托盤，并用封口膜把流動相管道密封于流動相瓶中，以防止流動相中有機系揮發(fā)。
2.按標準方法設置流速、波長、單針運行時間等儀器參數(shù)，并保存樣品方法、運行方法，平衡系統(tǒng)。
在本步驟中應該注意：
此時水已運行約30-50min，已達到了我們的目的，即把色譜柱內(nèi)原來的保存液替換為水，以防止原來的保存液和現(xiàn)在的流動相不相容，產(chǎn)生沉淀，損害色譜柱。
理論上平衡系統(tǒng)的時間大約為40min，或以基線是否平穩(wěn)來判斷。
延伸：
在設置方法時，我們要去編輯該藥品的方法或直接調用該方法。這里存在一個儀器使用權限的問題。按照cGMP的要求，應該符合3級管理權限，即維護人員權限、管理員權限、操作員權限（有的地方可能介紹的是4級或5級分類，我們要學習的是這種管理儀器的理念。如果有高手清楚可以賜教，在此先感謝?。?。操作人員只有調取方法的權限，是沒有更改或新建方法方法權限的。儀器管理員有分配操作人員調用方法和更改不適用方法的權限。但我們在液相上還很難做到這一點。但在我們新購入的TOC（總有機碳）測定儀上就實現(xiàn)了這個權限的分配。

第五步：稱量（此時的HPLC在走基線）
首先按照稱樣量的大小選擇合適的砝碼校正天平，然后開始正式稱量。此過程用時15-20min。
登記天平使用記錄。
在本步驟中應該注意：
1.稱取的樣品分別為系統(tǒng)適應性樣品（對照品+雜質或對照品加速實驗得到）、對照品、樣品等；可以使用減量法或直接稱量法稱??；稱量的范圍應按照藥典規(guī)定的精密稱量標準。
2.稱量完畢，天平歸零、打印出稱量數(shù)據(jù)并清理天平周圍的衛(wèi)生。
延伸：
在稱量過程中，樣品暴露于空中，噻肟藥粉會漂浮在空氣中，這是過敏源。因此，這一步的操作應該是在密封的層流罩內(nèi)進行。但我們還沒有做到，因為國內(nèi)還沒有廠家能做出在層流罩下使用十萬分子一電子天平的這套裝置。（這一點不知道國外是怎么做的？如果有高手知道可以賜教，在此先感謝?。?/p>

第六步：樣品溶解（此時的HPLC在走基線）
用燒杯盛裝標準方法規(guī)定的溶劑，溶解樣品。本實驗用的是水，我直接從超純水機獲取。本過程用時20-30min。
在本步驟中應該注意：
正確使用移液管，并按要求定容。如果標準方法規(guī)定，配好的樣品應立即進樣或保存在一定溫度下，則應該嚴格按要求操作。
按照上一步末尾提出的問題，此步驟仍然要在密封的層流罩內(nèi)進行，以防止過敏源的擴散。

第七步：設置工作站樣品表（此時的HPLC在走基線）
在樣品表中設置每個樣品在樣品盤中的位置、樣品批號、進樣針數(shù)、稱樣量，并調用已設置好的樣品方法到樣品表。
在設置樣品最后一針后，調入水（A通道，方法為：0.5ml/min、運行60min）和乙腈（B通道，方法為：0.5ml/min、運行120min）的方法，目的是進樣完畢后先用水沖洗色譜柱內(nèi)的流動相，后用乙腈保存色譜柱。
保存樣品表。
第八步：放樣
把容量瓶中的供試液和對照液分別裝入樣品瓶，按已編制樣品表中的順序放入樣品盤。
第九步：進樣
選擇合適的報告儲存路徑并判斷基線穩(wěn)定后，點擊開始進樣。
在本步驟中應該注意：
此時進樣，流動相已運行約50min，系統(tǒng)也已平衡。如果運行前看到基線不穩(wěn)，說明系統(tǒng)還未平衡，還需繼續(xù)運行流動相。
進樣后，有關液相操作的工作就完成了，剩下的是進樣完畢后打印圖譜。

第十步：處理剩余樣品、打印圖譜、計算含量
整個實驗完成后，把用過的玻璃器具歸到待清洗區(qū)域。進樣完畢，打印色譜圖，計算含量，整理好實驗記錄后，把記錄交于下個檢驗工序的化驗員。
在此過程應該注意：
1.由對照品圖譜主峰面積（5針）計算出校正因子的平均值和RSD（相對標準偏差），藥典中的要求是小于2%，我們內(nèi)部控制為小于0.5%。根據(jù)樣品圖譜主峰面積，把校正因子和水分帶入公式，即可計算含量。
2.如果記錄上填寫數(shù)據(jù)錯誤，應該用單線或雙線劃掉，在其上方或下方寫下正確的數(shù)據(jù)，并在旁邊簽字、日期。
3.由于實驗的對象是頭孢類物品，因此，已經(jīng)溶解而未用盡的樣品應倒入強堿罐內(nèi)滅活；未用盡得粉末統(tǒng)一回收。

總結：
個人認為按照這十步驟操作HPLC簡單且省時、省力，主要在于：在點擊樣品運行后，我們可以去做其他實驗，這也是自動進樣器的優(yōu)點；在用水沖洗色譜柱時，配置樣品的流動相；在走基線時，稱量樣品。這樣操作能節(jié)省很多時間。在文中提到的時間段，只是我個人在操作過程的記時。實驗過程中，根據(jù)個人對實驗熟練的程度，各個步驟的用時會有所變動，但只要順序不變同樣能達到省時、省力的目的。
備注：
1.運行時間計算：
根據(jù)方法設置里面單針運行時間、總進針數(shù)來判斷。按此試驗：對照品稱取2份，共進5針；樣品稱取7個樣，每個樣2份，各進1針，共14針。樣品單針運行12min，共進5+14=19針，用時為：12×19=228min。
2.流動相配制量計算：
樣品單針運行12min，共進19針，流速為1.2ml/min，那么共消耗的流動相為：12×19×1.2=273.6ml，加上前期平衡系統(tǒng)運行約40min，即40×1.2=48ml，共需要流動相273.6+48=321.6ml。我實際配置1000ml，剩余部分可在下次實驗時繼續(xù)用。但應注意，流動相應在有效期內(nèi)使用。